iGONAD2022 (2) complexとホストの準備

IDT注文のcrRNA/ssODN/PCR primer、だいたい2,3週間後に届きます。初回はtrRNA (Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA) も注文しないといけませんが、こちらは20 nmol頼めば20回分あるので、当面安泰です。ssODNは昔は5 nmolスケールのUltramerオリゴを頼んでいたのですが、Alt-R HDR Donor Oligosだと200 ntまで定額の16,000 yenで手に入るので、最近はこちらを利用しています。

まずは届いたオリゴの懸濁です。trRNAを頼むとduplex bufferが着いてくるのでそれで希釈してます。

crRNA 2 nmol (custom: 9,800 yen) -> 10 µlに懸濁
ssODN 2 nmol (custom: 16,000 yen) -> 3 µlに懸濁
trRNA 20 nmol (25,000 yen) -> 100 µlに懸濁

crRNAとtrRNAは溶かす容量がとても少量なので、しつこいぐらいにタッピングして、均一に、かつ、溶かし残しの無いようにしています。

次にduplexの形成。0.2 mlのPCR tubeにて

crRNA (200 µM) 5 µl
trRNA (200 µM) 5 µl

タッピングでよく混ぜたあと、さらに数回ピペッティングして、以下の条件でアニーリングさせています。

95ºC 1 min/(85ºC-1ºC x cycles) 5 sec) x 60 cycles/4ºC

アニールさせたduplexはPCRチューブのままパラフィルムでシールし、-80ºC保存。少なくとも2年は安定でした。

お次はcomplexの形成です。

duplex RNA 3 µl
Opti-MEM 5 µl
Alt-R^® HiFi Cas9 Nuclease V3 1 µl

こちらもタッピング＆ピペッティングでよく混ぜて、37ºC 10min

そして、ssODNを加えます。

+ 1 µl ssODN

ssODNはものすごく粘っこいので、これまたしつこいぐらいに（泡が出ない程度に）タッピング、ピペッティングしてます。こうしてできたcomplex + ssODNは4ºCで少なくとも1週間は安定なので、その間にプラグが付いたマウス3-4匹にiGONADすれば、目的の変異体が取れる勘定です。保存中に蒸発して濃度が変わったりするのが嫌なので、古のPCRのように、10 µlのミネラルオイルを重層して4ºCで保存しています。

10 µlのミネラルオイルを重層するとちょうどこんな感じ。泡入ってるのは愛嬌。

iGONADに使うホストのマウスですが、C57BL6ではなく、ICRを使っています。C57BL6でも全く問題なくできたのですが、F1、F2、F3同士の掛け合わせでホモ個体が全く出ずにlethal phenotypeだ！と喜んでいたら、F4同士の掛け合わせででバンバンviableホモ個体が出てきたという事例が立て続けにありまして、原因はよくわからないのですが、やはりある程度バッククロスをしてから解析しなくては危険かな、どうせバッククロスするんだからICRでいいかな、と思っています。予算にも優しいし。子育てうまいし。産仔数も多いし。染色体ごとにCNVマーカーがあるので、speed congenicとまでいかないまでも、それなりに早くバッククロスを揃えることは可能です。とりあえずこちらの論文にあった以下のマーカーを使っています。PCRの条件は

94ºC, 5 min/(94ºC, 30 sec/annealing temp, 30 sec(*)/72ºC, 30 sec)x35 cycle/72ºC, 1 min

です。ICRでSはB6よりも短いバンドが、Lは長いバンドが出ます。PAGEをしなくても、3%のLonza Metaphorアガロース in TBEで分離可能です。ここまで準備ができたら、あとはプラグが付いたときにiGONADのエレポをするだけ！その詳細は次回に。